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0:00o Olá pessoal tudo bem Hoje nós vamos
0:02falar sobre homem cima que integra duas
0:04vias bastante importantes do metabolismo
0:06mitocondrial nós vamos fazer a
0:08caracterização da enzima succinato
0:10desidrogenase uma Flávia proteína que
0:13participa tanto do ciclo de Krebs quanto
0:15da cadeia transportadora de elétrons na
0:17membrana mitocondrial interna mas vamos
0:19ver como é possível utilizar aceptores
0:21artificiais de elétrons para desviar o
0:23fluxo de elétrons que passa por essa
0:25enzima como sempre prepare as suas
0:26anotações e acompanha o protocolo do
0:29experimento através do livro didático ou
0:31do material disponibilizado pelo seu
0:32professor depois de uma breve explicação
0:34teórica nós vamos fazer um experimento
0:36de hoje uma boa aula a todos muito bem
0:49pessoal Vocês já viram na aula teórica
0:51que a enzima succinato desidrogenase
0:52também pode ser chamada de complexo dois
0:55da cadeia transportadora de elétrons ou
0:57de ubiquinona oxidorredutase
1:00os seus papéis é transferir elétrons
1:02para as moléculas de biquíni na na
1:04membrana mitocondrial interna essa
1:06enzima representa a integração do ciclo
1:08de Krebs aonde o suco sinato será
1:10oxidado até fumarato com a cadeia
1:12transportadora de elétrons uma vez que
1:14os elétrons provenientes da oxidação dos
1:16oficinato serão transferidos para uma
1:18molécula de Flaviana adenina
1:20dinucleotídeo Fábio que será reduzida
1:22até tarde H2 ainda no complexo dois
1:25esses elétrons serão transferidos para o
1:27centro ferro-enxofre da proteína e
1:30posteriormente a seguiram para a redução
1:31da ubiquinona transformou bithionol e
1:34dar continuidade a cadeia transportadora
1:35de elétrons até o aceptor final de
1:38elétrons que é o oxigênio essa enzima
1:40succinato desidrogenase Como o próprio
1:42nome já diz tem como substrato oxidado
1:45um dos intermediários do ciclo de Krebs
1:47um composto muito parecido com o
1:49succinato de chamado de malonato tem a
1:52capacidade de atuar no sítio ativo da
1:54sua assinatura desidrogenase como um
1:56inibidor competitivo ou seja na presença
1:59do malonato a em
2:00o Renato no sítio ativo da sua
2:02assinatura desidrogenase fica
2:04prejudicado impedindo portanto que ele
2:06seja convertido até fumarato
2:08consequentemente impedindo a redução do
2:10FAD até fazer H2 e interrompendo a
2:12respiração celular ou seja interrompendo
2:14a cadeia transportadora de elétrons
2:16nessa etapa nós podemos verificar o
2:18funcionamento da enzima succinato
2:20desidrogenase no laboratório utilizando
2:22substâncias chamadas de receptores
2:24artificiais de elétrons ou seja nós
2:27podemos desviar o fluxo de elétrons que
2:29teriam como aceptor final o oxigênio lá
2:32no complexo quatro da cadeia
2:33transportadora de elétrons para a
2:35sectores artificiais que podem ser
2:37introduzidos nas reações esses aceptores
2:39artificiais elétron possui um valor
2:41redox que favorecem com que os elétrons
2:43sejam transferidos para eles ao invés de
2:45serem transportados para os co-fatores
2:47de enzimas para molécula de fadinha que
2:49seria transformada em fase H2 um exemplo
2:52de molécula que funciona como um aceptor
2:53artificial de elétrons é o 235
2:57trifeniltetrazolio essa substância
2:59quando nossa forma
3:00e tem cor amarela bastante Clara
3:02praticamente transparente quando
3:04reduzida entretanto Ou seja quando
3:06recebe elétrons de alguma reação o
3:09trifeniltetrazolio se transforma em
3:11preferiu formasan na que é um composto
3:13que tem cor vermelha bastante intensa
3:15portanto se nós fizemos um sai
3:17enzimático utilizando a sua assinatura
3:18desidrogenase junto com seu substrato
3:21succinato e adicionarmos o
3:23trifeniltetrazolio a esse meio de reação
3:25nós podemos observar 6mm está realizando
3:27a oxidação dos oficinato até fumarato
3:29desviando os elétrons que seriam
3:31utilizados para reduzir o Fábio para
3:33reduzir o tetrazólio se essa redução
3:36acontecer o tetrazólio vai virar
3:38formosana e o meio vai ficar vermelho se
3:41alguma coisa interferir nessa reação
3:42enzimática entretanto não vai ser
3:44visualizado nenhum composto de cor
3:46vermelha no experimento Então é isso que
3:49nós vamos fazer no nosso único
3:50experimento de hoje nós vamos utilizar
3:51uma suspensão de mitocôndrias obtida de
3:54fígado de rato para observar o
3:56comportamento da sua assinatura
3:57desidrogenase em diferentes condições cá
4:00o que nós vamos utilizar a seguir terá
4:02uma composição diferente então para que
4:04você compreenda bem O que está
4:05acontecendo nesse experimento deu uma
4:08olhada com bastante cuidado na tabela de
4:09composição dos seis tubos de ensaio que
4:12nós vamos utilizar muito bem pessoal
4:13então no nosso tubo um nós vamos ter
4:16apenas tampão fosfato PH 7,2 solução de
4:20sucos inato que é o substrato da nossa
4:23reação e o tetrazólio 0 25 ml de
4:26tetrazólio e se tu vai ser o nosso turno
4:29Branco uma vez que nós não vamos colocar
4:31a suspensão de mitocôndrias ou seja não
4:33vai ter a sua assinatura desidrogenase
4:35nesse túmulo
4:38e no tubo 2 nós vamos ter também tampão
4:41nós não vamos colocar a solução de sucos
4:43Renato nesse tubo 2 portanto nós não
4:45estamos adicionando o substrato da
4:47reação nesse túmulo
4:49nós vamos colocar o tetrazólio e nós
4:52vamos colocar 0,2 ml de uma suspensão de
4:55mitocôndrias frescas funcionais
4:58o YouTube três além do tampão nós vamos
5:00ter o succinato que é o nosso substrato
5:02também vamos ter o tetrazólio Nossa
5:04receptor artificial de elétrons e nós
5:07vamos colocar a 0,2 ml de uma suspensão
5:09de mitocôndrias servidas Você já sabe o
5:13que acontece quando a gente aquece uma
5:14proteína Então já sabe o que vai
5:16acontecer com a sua assinatura
5:18desidrogenase que vai estar presente
5:20nessas mitocôndrias
5:22o último quatro nós vamos ter o tampão
5:25também vamos ter o suco sinato também
5:27vamos ter o tetrazólio e vamos ter 02 ml
5:30de uma suspensão de mitocôndrias frescas
5:33funcional portanto como vocês podem
5:35notar o tubo 4 vai ter todos os
5:37componentes necessários para que a
5:39reação se processe de forma plena vai
5:42ter a enzima funcional tem o substrato e
5:44vai ter o aceptor artificial de elétrons
5:46a essa altura do curso a gente já pode
5:49prever o resultado que a gente vai ver
5:50nesse tubo 4 o tubo 5 e outubro seis
5:54pessoal eles são praticamente idênticos
5:56com uma diferença bastante importante
5:58ambos vão ter 0,2 ml de uma solução de
6:02malonato Cês já viram que eu malonato é
6:04um inibidor competitivo da
6:06succinato-desidrogenase a diferença
6:09entre o tubo 5 outubro 6 é que o tubo
6:11cinco vai ter 0,1 ml da solução de fluxo
6:14Renato 0,1 ml da solução do substrato
6:17próprio da enzima
6:19Oi Ju tudo cês vai ter dez vezes mais a
6:21quantidade de sucos inato ou seja nós
6:23vamos colocar 1 ml da solução de fixe
6:26Nato então ambos vão ter uma Lonato mais
6:29a concentração de sucos inato no tubo 6
6:31vai ser dez vezes maior Então vamos lá
6:34para bancada preparar esse experimento e
6:36ver quais são os resultados que nós
6:38vamos obter
6:39e não é que a gente começar o
6:40experimento propriamente dito nós
6:42precisamos preparar uma amostra de
6:44suspensão de mitocôndrias servidas que
6:47vai ser utilizada em um dos nossos tubos
6:48para isso nós vamos pegar 0,2 ml da
6:52nossa suspensão de mitocôndrias e vamos
6:56solubilizar em 3 ml de tampão fosfato PH
7:007,2 e essa solução essa suspensão de
7:04mitocôndrias no tampão vai ser fervida
7:07durante 10 minutos vamos preparar esse
7:10tubo
7:17é tão 3ml da nossa solução tampão e 0,2
7:25ml da nossa suspensão de mitocôndrias
7:3310 2 ml da suspensão de mitocôndrias
7:39o Tom a gente agita e esse tubo aqui com
7:43essas mitocôndrias vão agora ser
7:45servidas por 10 minutos então vamos
7:48colocar elas lá no banho-maria tá darmos
7:51prosseguimento ao resto do experimento
7:54eu tô muito bem pessoal já fervemos a
7:56nossa suspensão de mitocôndrias passou
7:59dez minutos no banho maria a 100 graus e
8:03agora a gente já pode realizar o nosso
8:05experimento com todos os tubos que nós
8:08vamos verificar hoje então eu já deixei
8:10separado aqui vocês tubos que nós vamos
8:12usar em todos eles Eu já coloquei o
8:15tampão nas quantidades que vocês viram
8:17na tabela todos eles também já tem a
8:20solução de subs inato de sódio - ho-ho
8:24tubo 2 o tubo 2 não tem isso piccinato
8:27então o tubo 2 vai ser o tubo que a
8:28gente não está colocando o substrato da
8:31nossa em cima os demais tubos vão ter
8:340,1 ml de solução de socos inato menos o
8:38tubo 6 que vai ter um ml de tampão de
8:42solução de fluxo inato tão lembrem-se o
8:45dois não tem nada disso piccinato os
8:48seis tem 1 ml da solução de socse Nato e
8:52o tubo 134
8:5415 tem 0,1 ml da solução de succinato do
8:59nosso substrato Eu já coloquei também
9:02todos eles 0,25 ml de solução de
9:06trifeniltetrazólio que o nosso aceptor
9:09artificial de elétrons e no tudo cinco
9:13minutos seis já foi colocado também 0,2
9:16ml de malonato tão tubo um dois três e
9:20quatro não tem malonato o tubo 5 outubro
9:236 vão ter 02 ml de malonato solução de
9:28malonato a única coisa que falta a gente
9:31adicionar os tubos agora é a nossa
9:33enzima que se encontra na solução na
9:36suspensão de mitocôndrias
9:38bom então no tubo nós não vamos
9:40adicionar nenhuma mitocôndria não vamos
9:43adicionar nenhum ml da suspensão de
9:44mitocôndria no tubo 2 4 5 e 6 nós vamos
9:50utilizar a solução ou a suspensão de
9:54mitocôndrias viáveis de mitocôndrias
9:56frescas e no tubo 3 nós vamos utilizar a
10:02nossa suspensão de mitocôndrias fervida
10:05Ok então vamos colocar a suspensão de
10:09mitocôndrias nos tubos dois até o tudo
10:11cês o tubo 3 vai ser a suspensão fervida
10:17bom então já vou colocando tudo três
10:19primeiro
10:21E aí
10:2310 2 ml
10:26e no tubo 3
10:30E aí
10:33E aí
10:35os hinos de mais estudos 0,2 ml da
10:40suspensão fresca tão no tubo 2
10:46E aí
10:51o tubo 4
10:59E aí
11:01o tubo 5
11:06E aí
11:07E aí
11:09Ah e tudo sei se eu tô colocando o
11:11direto na solução sem deixar escorrer
11:13pelo tudo porque como é uma suspensão
11:15viscosa
11:17e pode grudar na parte de dentro do tubo
11:20de ensaio da Encosta na solução não vai
11:22adiantar nada tá então estão prontos os
11:25nossos tubos vamo agitar
11:28E aí
11:29E aí
11:32E aí
11:35já estão prontos os nossos tubos para
11:37gente verificar o resultado desse
11:39experimento todos esses tubos agora
11:41precisam ficar incubados a 37 graus por
11:4430 minutos então vamos colocar eles lá
11:47no banho-maria 37 graus para gente
11:50conseguir verificar o que que vai
11:52acontecer
11:54e o que pessoal então estamos aqui na
11:56bancada com o nosso banho já a 37 graus
12:00e os tubos que a gente acabou de
12:02preparar vou ficar incubados aqui por 30
12:06minutos para gente conseguir ver
12:08e o resultado desse experimento
12:12eu vou marcar aqui 30 minutos
12:17E é só aguardar
12:23é muito bem pessoal então transcorrido
12:26os 30 minutos dia reação podemos parar o
12:30nosso cronômetro e podemos tirar os
12:32tubos para ver o resultado desse
12:34experimento
12:36e tirar aqui para mostrar para vocês
12:45é muito bem
12:47e o que que nós temos aqui pessoal
12:51e os nossos seis tubos contém o
12:55trifeniltetrazolio Ou seja aquele
12:57aceptor final de elétrons que quando
12:59reduzido quando recebe os elétrons vai
13:02ficar de cor vermelha então aqui nos
13:04respondem observar a intensidade da cor
13:06vermelha que representa a redução do
13:08tetrazólio para formar Ana
13:11e como vocês podem ver o tubo um ficou
13:14praticamente transparente nosso tubo
13:17branco
13:18o último dois ficou com rosa bem
13:20clarinho
13:22e o tubo 3 ficou praticamente igual ao
13:25tubo Branco praticamente transparente
13:29o último quatro nós temos a maior
13:31intensidade da cor vermelha Entre todos
13:34os todos
13:35o YouTube cinco ficou um pouco mais
13:38claro do que eu tomo quatro mas ainda
13:41assim dá para perceber que foi formada a
13:43formação na foi reduzida o tetrazólio
13:46para formar o armazena e outros seis
13:48ficou um pouquinho mais escuro um
13:51pouquinho mais forte intensidade do
13:53vermelho em relação ao todo cinco e um
13:55pouquinho mais fraco em relação ao tomo
13:574
13:59bom então vamos limpar o quadro para
14:00gente analisar cada uma dessas situações
14:02individualmente
14:04bom então vocês viram pessoal que cada
14:06um dos tubos apresentou uma intensidade
14:08de coloração vermelha diferente que é
14:11relativa a redução do tetrazólio até
14:13forma zona e que portanto indica a
14:15atividade da enzima succinato
14:16desidrogenase nós podemos expressar os
14:19resultados observados através de uma
14:20tabela de intensidade da cor vermelha
14:22para facilitar a interpretação dos
14:24resultados então vocês perceberam que o
14:26tubo um aonde não haviam mitocôndrias e
14:29portanto não havia enzima succinato
14:30desidrogenase apresentou por
14:32transparente ou seja a intensidade do
14:34vermelho foi a mínima possível uma vez
14:37que não houve a conversão de sucos
14:38Renato até fumarato e portanto não houve
14:40a transferência dos elétrons até o
14:42tetrazólio esse tubo ou que nós podemos
14:44chamar do tubo branco ou seja é o tubo
14:47que diz que nós temos 10 de quantidade
14:48de tetrazólio reduzido até forma ano no
14:51segundo turno nós não colocamos a
14:53solução de fluxo inato mas nós colocamos
14:550,2 ml de uma suspensão de mitocôndrias
14:58frescas e vocês observarão que o como
15:00ficou um pouquinho vermelho ele ficou
15:02com uma intensidade de vermelho bem
15:04o porquê que isso acontece porque dentro
15:06das mitocôndrias que nós adicionamos a
15:08solução tem um pouquinho de succinato é
15:11o que a gente chama de suco sinato
15:12endógeno então Mesmo não tendo
15:14adicionado solução de surf Natal meio
15:16esse pouco succinato endógeno que estava
15:19presente nas mitocôndrias foi oxidado
15:21até fumarato os elétrons foram
15:23transferidos até o trifeniltetrazolio
15:25que foi reduzido Até formar Ana que
15:28gerou um pouquinho de composto de cor
15:29vermelho uma vez esgotadas se
15:31reservatório endógeno succinato a reação
15:34sessa o nosso tubo 3 vocês observarem
15:36também que praticamente não houve
15:38formação de forma asana ou seja a
15:40intensidade da cor vermelha foi
15:42praticamente nula nesse tubo nós
15:44colocamos 0,2 ml de uma suspensão de
15:47mitocôndrias feridas quando você ferve a
15:49suspensão de mitocôndrias você Deus
15:51Natura todas as proteínas que estão
15:53presentes nas organela incluindo
15:55assassinato desidrogenase que
15:56consequentemente vai perder a sua função
15:58portanto no tubo 3 mesmo tendo colocado
16:01succinato no meio uma vez que em cima
16:03não está
16:04e não houve oxidação do succinato não
16:07houve a transferência de elétrons e você
16:09observou que nada do tetrazólio foi
16:11reduzido até a forma na os nossos
16:13próximos três tubos são bastante
16:15importantes pessoal então Observe o que
16:17aconteceu no tubo 4 outubro quatro nós
16:19temos solução de succinato que é o
16:22substrato nós tínhamos a suspensão
16:24frescas mitocôndrias portanto a enzima
16:26succinato desidrogenase estava funcional
16:29temos o tampão que garantia a manutenção
16:31do PH do Meio tínhamos o aceptor
16:33artificial de elétrons e colocamos essa
16:35mistura uma temperatura adequada para
16:37que a reação pudesse esse transcorrer de
16:39forma adequada nós temos todos os
16:41fatores necessários Então para que a
16:43reação enzimática esse processo de
16:45maneira satisfatória nisso de fato foi
16:47observado pela intensa cor vermelha
16:48observado nesse tubo Ou seja a enzima
16:52succinato desidrogenase funcionando
16:54catalisou a oxidação de grande
16:56quantidade de substrato consequentemente
16:58os elétrons retirados desse processo de
17:00oxidação foram em grande parte
17:02transferidos para o
17:04o que gerou portanto a formação em
17:06grande quantidade e que deu essa cor
17:08vermelha intensa ao nosso Tubo o tubo 4
17:11é o que nós podemos chamado o nosso
17:13teste positivo o nosso controle positivo
17:15é o tubo de maior intensidade de reação
17:17observado nesse experimento no túmulo
17:20cinco Nós também tínhamos o piccinato e
17:23também tínhamos enzima funcional
17:24entretanto nós colocamos 0,2 ml de uma
17:27solução de malonato que você já viram eu
17:30inibidor competitivo da sua assinatura
17:32desidrogenases que significa que quando
17:34uma Lonato estiver presente o sítio
17:36ativo da enzima vai estar indisponível
17:38para que o SUS inato seja transformado
17:41em fumarato existe uma competição entre
17:43os sucos inato eo malonato pelo sítio
17:45ativo da enzima o que acaba prejudicando
17:47a conversão de succinato em formato
17:50dessa forma menos oficinato é oxidado
17:53menos elétrons são transferidos para o
17:55tetrazólio e a cor vermelha derivada da
17:57forma Zana também um pouco menos intenso
18:00já não tudo seis o que nós observamos é
18:02que a concentração de isso
18:04o que nós adicionamos foi 10 vezes maior
18:07em relação à presente no tubo 5 ou seja
18:10no tubo 6 a competição pelo sítio ativo
18:13da sua assinatura desidrogenase vai ser
18:15mais favorecida para os sucos inato que
18:17está presente em uma concentração muito
18:19maior ainda assim a presença do malonato
18:22ainda atrapalha na oxidação do succinato
18:24pela enzima O resultado é que a
18:26intensidade da cor vermelha no tubo 6 é
18:28o maior do que no topo 5 e menor do que
18:30na turma 4 a onde não havia nenhum tipo
18:33de inibidor Então por hoje era isso
18:35Pessoal vocês viram que no nosso único
18:37experimento de hoje que era
18:38relativamente simples nós podemos
18:40observar várias coisas importantes a
18:42respeito do funcionamento da enzima
18:43succinato desidrogenase eu espero que
18:46vocês tenham entendido e gostado da aula
18:48e até a próxima
18:52E aí
18:55E aí